蛋白酶K（Proteinase K），相对分子量约为29.3 kDa, 是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。可切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，应用广泛，可用于制备脉冲电泳的染色体DNA，蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶等实验，蛋白酶K的一般工作浓度是50—100µg /ml。因蛋白酶K在变性剂如SDS（1%）中可提高其活性，所以在使用中，常根据所用缓冲液是否含有SDS、尿素、pH、温度等因素确定具体的工作浓度。蛋白酶K在较广的pH范围内（pH 4-12.5）均有活性。
蛋白酶K有两个Ca2+结合位点，它们离酶的活性中心有一定距离，与催化机理并无直接关系。然而，如果从该酶中除去Ca2+，由于出现远程的结构变化，催化活性将丧失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染核酸制品的蛋白质。所以，蛋白酶k消化过程中通常也加入EDTA（以抑制依赖于mg2+的核酸酶的作用）。但是，如果要消化对蛋白酶k具有较强耐性的蛋白，如角蛋白一类，则可能需要使用含有1mmol/l Ca2+而不含EDTA的缓冲液。在消化完毕后、纯化核酸前要加入EGTA（ph8.0）至终浓度为2mmol/l，以鳌合Ca2+。